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重磅 | ChIP-qPCR太麻煩？看CUT&Tag如何彎道超車！

發(fā)布時間：

2023-11-30

在表觀遺傳學(xué)中，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)-DNA互作研究技術(shù)ChIP和CUT&Tag在二代測序技術(shù)的加持下大放異彩，通過文庫構(gòu)建和豐富的生物信息學(xué)分析，能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的 DNA 區(qū)段。但整個實驗流程費時費力，對于某些特定基因位點的檢測，二代測序的成本較高，搭配速度快、成本低的qPCR是更明智的選擇。

qPCR在關(guān)注特定基因和潛在調(diào)控區(qū)域的研究中具有成本低、實驗限制少的優(yōu)勢，可應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)，腫瘤機制研究以及組蛋白修飾對基因表達的影響等。但實現(xiàn)CUT&Tag-qPCR也并非易事，因為CUT&Tag的技術(shù)路線與ChIP有所不同，在ChIP實驗中，被抗體特異性抓取的片段一般是目的基因片段，因此可以直接進行qPCR檢測。而在傳統(tǒng)的CUT&Tag實驗流程中，是通過裂解細胞，回收全基因組，并擴增帶有Tn5粘貼接頭的DNA片段，達到對目的DNA片段進行文庫構(gòu)建的目的。因此，CUT&Tag兼容qPCR的關(guān)鍵點和難點在于回收的片段必須是被Tn5切割的目的片段。

圖1. 蛋白質(zhì)-DNA互作研究技術(shù)實驗流程

a、ChIP-seq，b、CUT&RUN-seq，c、CUT&Tag-seq。

（Kaya-Okur HS, Henikoff S. ,Nat Protoc, 2020 ）

CUT&Tag Pro試劑盒（Vazyme #TD904）進行了定向優(yōu)化，可以同時兼容建庫和qPCR——核心酶pA/G-Tnp和DNA提取磁珠的聯(lián)合升級，實現(xiàn)了靶向切割、特異性回收目的片段的功能。使用TD904僅需5分鐘，即可釋放DNA Extract Beads Pro抓取到的目的DNA片段，以其為模板進行qPCR檢測，判斷目的基因是否有富集。同時，通過TD904獲得的模板適用于各種qPCR試劑和程序。

與ChIP-qPCR相比，CUT&Tag-qPCR兼容低細胞投入量、不需要交聯(lián)、超聲打斷等步驟，操作難度更小、耗時更短、抗體兼容性更強。在Vazyme CUT&Tag系列試劑盒中，只有TD904可以對目的基因進行qPCR檢測，如果有這方面的實驗需求，千萬不要選錯試劑盒了喲！

圖2. CUT&Tag試劑盒提取技術(shù)原理

CUT&Tag Pro試劑盒（Vazyme #TD904）在不同細胞投入量的293細胞中對組蛋白H3K4me3體系進行了CUT&Tag-qPCR實驗，本試劑盒可兼容100 - 100,000細胞，在低細胞投入量下仍有良好表現(xiàn)。對于不同豐度的靶點我們也對多個目的基因設(shè)計了引物進行檢測，相較于陰性對照IgG，實驗組中目的基因均有顯著富集。

圖3. 不同細胞投入量下CUT&Tag-qPCR實驗結(jié)果

（A）不同細胞投入量下Positive Control C_T值，（B）不同細胞投入量下DNA Spike-in C_T值，（C）和（D）Positive Control相較于IgG的相對富集倍數(shù)。

圖4. 不同靶蛋白CUT&Tag-qPCR實驗結(jié)果

由于應(yīng)用方向和技術(shù)原理的相似性，CUT&Tag-qPCR的數(shù)據(jù)計算方式和結(jié)果體現(xiàn)形式可以參照ChIP-qPCR。ChIP-qPCR兩種主流的計算方法包括Percent Input法和Fold Enrichment法。Percent Input法需要引入CUT&Tag實驗流程并不需要的Input，因此不適用于CUT&Tag-qPCR的實驗結(jié)果計算。Fold Enrichiment法引入了IgG，IgG理論上是不能特異性富集任何DNA片段，因此IgG可以作為陰性對照參與計算富集倍率，這不僅能夠用于對照組和處理組相對富集倍率的計算，也能夠滿足單組單基因的富集驗證，計算方法與常規(guī)qPCR類似，采用2^-△△CT法對C_T值進行處理和計算，通過數(shù)據(jù)分析軟件（如SPSS）比較陰性對照組和實驗組之間是否存在顯著差異。